Репортерный ген xylE с сайтом связывания рибосом
Ген xylE из Pseudomonas putida TOL (нафтален- и ксилен-деградирующая плазмида) pWW0 кодирует катехол-2,3-диоксигеназу (метапирокатехазу). Фермент превращает катехол в ярко-желтый 2-гидрокси-cis,cis-муконовый семиальдегид (максимум поглощения при 377 nm). Полезный репортерный ген, поскольку катехол – дещевый бесцветный субстрат.
Фрагмент содержит нативный сайт связывания рибосом, в связи с этим для репортерных функций нужен только подходящий промотор.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_J33204
Разработчик: Chris French Группа: iGEM2006_Edinburgh (2006-10-17)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 8-1, дор. 4). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3028 п.н.
Рисунок 8-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 8-2, дорожка 4).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 999 п.н.
Рисунок 8-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
