5' интеграционная последовательность для amyE локуса B. subtilis
Интеграционные последовательности позволяют вводить фрагменты ДНК в хромосому клетки-хозяина по определенному локусу. Это достигается использованием leading (5 ') и trailing (3') последовательностей ДНК, индентичных конкретным сайтам на хромосоме.
Локус amyE locus - первый локус, который стали использовать для интеграции в B. Subtilis. Его часто используют в векторах, таких как pDR111#2, pDL#3 и их производных. Интеграция по локусу amyE нивелирует способность B. subtilis расщеплять крахмал, что можно выявить при помощи йода.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K143001
Разработчик: Chris Hirst Группа: iGEM08_Imperial_College (2008-08-27)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 6-1, дор. 7). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2592 п.н.
Рисунок 6-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI, EcoRV. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 6-2, дорожка 7).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 563 п.н.
Рисунок 6-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
