Bacterial-Mammalian промотор с eCFP репрортером: BBaK216005 + CArG промотор + BBa_E0420
Гибрибный промотор, содержащий бактериальный промотор PyeaR с mammalian CArG элементом (для использования и в бактериальных клетках, и клетках млекопитающих). Оба отвечают на экзогенные соединения азота. Соединен с репортером enhanced Cyan Fluorescence Protein (eCFP).
Осадки E. coli, трансформированных этим фрагментом, пришитым к BBa_E0420 (RBS и CFP репортер), и выращенных в среде с азотнокислым калием. Слева направо концентрации азотнокислого калия: 10 mM, 50 mM, 100 mM и 0 mM
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K774004
Разработчик: NRP-UEA-Norwich Группа: iGEM12_NRP_UEA-Norwich (2012-09-19)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 9-1, дор.9). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3164 п.н.
Рисунок 9-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 9-2, дорожка 9).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 1135 п.н.
Рисунок 9-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
