Cel5A, эндоглюканаза
Ген cel5A клонирован из Penicillium decumbens 114-2. Уровень экспрессии cel5A is репрессируется глюкозой и индуцируется целлюлозой. Фермент рандомно гидролизует β-1,4-глюканы, работает на длинных целлюлозных цепях. Основной продукт – олигомер глюкозы. Синергично взаимодействует с β-1,4-глюкозидазой, достигая высокой эффективности гидролиза. Обладает высокой способностью гидролизовать кристаллическую целлюлозу, но низкой активностью в отношении карсбоксиметилцеллюлозы, β-глюкана ячменя и PASC.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K805011
Разработчик: Liu Ping Группа: iGEM12_HUST-China (2012-09-20)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 8-1, дор. 3). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3303 п.н.
Рисунок 8-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 8-2, дорожка 3).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 1274 п.н.
Рисунок 8-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
