''Deinococcus radiodurans'' супероксид-дисмутаза, SodCu/Zn
Deinococcus radiodurans – чрезвычайна устойчивая к радиации бактерия: в то время как 10 Gy (доза поглощения радиации, Gray) может убить большинство позвоночных, D. radiodurans выдерживает 12 000 Gy.
Основные эффекты радиационного воздействия на бактериальные клетки - повреждение ДНК и генерация токсичных супероксидов. Чтобы утилизировать последние, D. radiodurans экспрессирует высокие уровни супероксид-дисмутаз, превращающих супероксиды в кислород и перекись водорода. Эти ферменты используют цинк и медь в качестве кофакторов.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K847004
Разработчик: Rashmi Sharma, Vishesh Jain, Kendrick Wang Группа: iGEM12_Stanford-Brown (2012-08-09)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 5-1, дор.6). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2619 п.н.
Рисунок 5-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 5-2, дорожка 6).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 590 п.н.
Рисунок 5-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
