DNA-лигаза Escherichia coli (LigA) с PT7, RBS и His-tag
Применение в биологии
Бактериальные DNA лигазы – важные ферменты для репарации DNA и репликации. Используют кофактор NAD+ для образования связи AMP с лизином в своем активном центре, при этом высвобождают NMN. AMP используется для катализа реакции образования фосфодиэфирной связи в «никах» на DNA путем переноса AMP к 5'-фосфатной группе. Это приводит к атаке группой 3'-OH «ника» 5'-фосфоангидридной связи и высвобождению свободного AMP:
Важные параметры
Table 1: Параметры NAD+-зависимой DNA лизазы E. coli (LigA). Количество аминокислот, молекулярная масса, теоретический pI и коэффициент экстинкции рассчитаны с помощью ExPASy Translate и Expasy ProtParam.
|
Эксперимент |
Характеристика |
Результат |
|
Экспрессия |
|
|
|
Совместимость |
E. coli KRX |
|
|
Промотор |
PT7 |
|
|
Индукция экспрессии |
L-рамноза для индукции T7 полимеразы |
|
|
Optimal temperature |
37 °C |
|
|
Очистка |
|
|
|
Количество аминокислот |
678 |
|
|
Молекулярная масса |
74.59 kDa |
|
|
Теоретический pI |
5.59 |
|
|
Коэффициент экстинкции при 280 nm |
37400 (предполагая, что все пары остатков Cys образуют цистины) 36900 (предполагая, что все остатки Cys восстановлены) |
|
|
Tag |
C-terminal 6xHis |
|
|
NAD+ детекция |
|
|
|
Предел детекции |
2 nM |
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K525710
Разработчик: Anna Drong Группа: iGEM11_Bielefeld-Germany (2011-09-12)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 4-1, дор.8). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 4174 п.н.
Рисунок 4-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции PvuII. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 4-2, дорожка 8).Ожидаемая длина фрагментов 2353 п.н., 1008 п.н., 773 п.н.
Рисунок 4-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
