''Escherichia coli'' osmoregulatory trehalose synthesis B (otsB)
Ген кодирует фермент для второго этапа синтеза трегалозы. Этот дисахарид предположительно обладает осмопротекторными свойствами (Calahan, Dunham, DeSevo, and Koshland 2011), тем не менее его роль в резистентности к высушиванию до конца не выяснена (Calahan et al. 2011).
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K847061
Разработчик: Rashmi Sharma, Vishesh Jain, Kendrick Wang Группа: iGEM12_Stanford-Brown (2012-08-09)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 5-1, дор.5). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2871 п.н.
Рисунок 5-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 5-2, дорожка 5).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 842 п.н.
Рисунок 5-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
