Fusion part of pBAD arabinose-inducible induction system and the HRV 14_3C protease
BioBrick составлен из арабиноза-зависимой системы индукции и протеазы HRV 14_3C.
Общая информация о фрагментах
HRV 14_3C
Рекомбинантная протеаза 14_3C человеческого риновируса (HRV 3C) распознает сайт LeuGluValLeuPheGln/GlyPro (как и нативный фермент)
Молекулярный вес протеазы: 22 kDa. Оптимальная активность при 4°C, но активна и при 37°C. В активном центре содержит остатки Ser-Asp-His.
Арабиноза-зависимая система индукции
Система получена путем ПЦР-амплификации с вектора pBAD_iGEMexpress vector. Без индукции арабинозой уровень экспрессии очень низок благодаря ингибиторной функции белка CAP (catabolic activator protein). Для высого уровня экспрессии используется арабиноза в концентрациях от 2 mM до 50 mM. Арабиноза необходима для потери функции белка CAP.
В данном случае добавление в систему арабинозы приводит к очень высокому уровню экспрессии протеазы HRV 14_3C.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K627011
Разработчик: iGEM11 Potsdam_Bioware Группа: iGEM11_Potsdam_Bioware (2011-09-21)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 5-1, дор.2). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3864 п.н.
Рисунок 5-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI, BamHI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 5-2, дорожка 2).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 1165 п.н., 670 п.н.
Рисунок 5-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
