RBS(B0034)_MBP(свинец-связывающий белок egineered from PbrR)+Терминатор(B0015)
Фрагмент предназначен для получения свинец-связующего белка. Разработан для экспрессии в цитозоле, но при слиянии с белком периплазмы DsbA и мембранным белком Lpp-OmpA будет транслоцироваться в периплазму и мембрану, соответственно.
Семейство факторов транскрипции MerR имеет высокое сходство с С-концевым металл-связывающим доменом, что указывает на сходный механизм распознавания металлов и металл-белковых комплексов. В предыдущей работе было показано, что С-концевой металл-связывающий домен может аккумулировать металл без помощи N-концевого ДНК-связывающего домена.
Функциональный тест для ртутного металл-связывающего белка (MBP) показал, что цельно-клеточные биоабсорбенты могут поглощать более 50% 10-6 М Hg (II) за 120 минут, что указывает на то, что клетки, экспрессирующие металл-связывающий пептид, сконструированный с помощью нашего метода, могут обеззараживать водную среду, аккумулируя данный ион металла. Этот дизайн был успешно применен к другому гомологу семейства MerR - PbrR, свинец-респонсивному регулятору. В нашем проекте мы попытались сделать тандем из двух копий металл-связывающих доменов для для получения высокоэффективного и менее энергозатратного металл-связывающего пептида. Наши бактерии достигли емкости накопления свинца, эквивалентной ртутному MBP, что доказает валидность нашей инженерной стратегии.
На рисунке избражены структуры PbrR и MBP(свинец). Слева структура PbrR, члена семейства MerR. Справа приведена предсказанная структура металл-связывающего пептида, полученного на основе PbrR. Ионы свинца показаны как черные шарики в металл-связывающих карманах.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K346004
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 1-1, дор.1). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2549 п.н.
Рисунок 1-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 1-2, дорожка 1).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 520 п.н.
Рисунок 1-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
