T7rnap (T7 RNA Polymerase) - ATG Start Codon
Ген T7 РНК-полимеразы (ATG Start), транскрибирующей любые гены под T7 промотором. Позволяет достичь высоких PoPS (Polymerases Per Second), обладает высокой степенью независимости от транскрипционной системы E. Coli. Имеет ATG старт-кодон (активнее варианта с GTG ), но весьма токсичен и потенциально нестабилен при хранении при -80.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_I716103
Разработчик: David Tulga Группа: iGEM07_Berkeley_UC (2007-06-09)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 2-1, дор.3). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 4722 п.н.
Рисунок 2-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 2-2, дорожка 3).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 2693 п.н.
Рисунок 2-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
