Желтая люцифераза светлячка (под pBAD) L. Cruciata
Люцифераза дикого типа из Luciola cruciata с люциферин-регенерирующим ферментом, находящиеся под контролем индуцируемого арабинозой промотора
Фрагмент основан на BBa_K325219. Модификации внесены с помощью сайт-направленного мутагенеза. Мутация Pro452Ser позволила получить желтую биолюминисценцию.
Цвета эмиссии
Фрагмент оптимизирован по кодонам для экспрессии в E.coli.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K325259
Разработчик: Ben Reeve and Emily Knott Group: iGEM10_Cambridge (2010-10-23)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 3-1, дор.5). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 5911 п.н.
Рисунок 3-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 3-2, дорожка 5).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 3828 п.н.
Рисунок 3-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
