Интеграза фага микобактерий Bxb1 gp35
Bxb1 – фаговая интеграза, опосредующая сайт-специфическую рекомбинацию между двумя специфическими последовательностями ДНК - 'attP' и 'attB' (phage attachement site и the bacterial attachment site)
Принадлежит к семейству сериновых интеграз, распознает короткие attP и не требует кофакторов хозяина. Эффективный инструмент для создания «logic gates».
Литература
[1] Salis, Howard M., Ethan A. Mirsky, and Christopher A. Voigt. "Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression." Nature biotechnology 27.10 (2009): 946-950.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K907000
Разработчик: Dong-hui Choe, Soo-in Lee Группа: iGEM12_KAIST_Korea (2012-09-20)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 6-1, дор. 3). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3573 п.н.
Рисунок 6-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 6-2, дорожка 3).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 1544 п.н.
Рисунок 6-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
