Кассета для сильной конститутивной экспрессии
Фрагмент включает f1 origin K314110, сильный экспрессионный промотор J23100 и стандартный Elowitz сайт связывания рибосом B0034. При лигировании с белок-кодирующей последовательностью по сайту SpeI, «сайт-шрам» создаст правильный интервал для экспрессии белка.
BBa_E0040 (GFP) был вставлен между S и P с помощью стандартной сборки BioBrick. Полученные конструкции были трансформированы в DH5a клетки (конститутивные промоторы BBa_J23100 или BBa_J23114, а также индуцибельный промотор BBa_R0011) или BL21(DE3)* клетки (T7 промотор, BBa_K314104), которые растили в течение ночи при 298K в присутствии/отсутствии 0.5mM IPTG. Клетки были собраны, отмыты в PBS, затем флюоресценция была измерена на флюориметре (ex. 485, em. 525) и нормализована на клеточную плотность (OD600). Клетки не содержащие GFP были использованы как референс. Как мы показали, добавление IPTG значимо увеличивало флюоресценцию клеток.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K314100
Разработчик: Tomas Huber, Justin Siegel Группа: iGEM10_Washington (2010-10-08)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 1-1, дор.2). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2588 п.н.
Рисунок 1-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 1-2, дорожка 2).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 559 п.н.
Рисунок 1-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
