Красная люцифераза светлячка и LRE L. Cruciata
Фрагмент содержит кодирующую последовательность мутантного светоизлучающего фермента (люциферазы) и люциферин-регенерирующего фермента (LRE) из японского светлячка Luciola cruciata.
Люциферин-регенерирующий фермент превращает оксилюциферин в CHBT. CHBT конвертируется в люциферин в присутствии D-цистеина
Фрагмент оптимизирован по кодонам для экспрессии в E.coli.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K325210
Разработчик: Hannah Copley and Theo Sanderson Группа: iGEM10_Cambridge (2010-09-15)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 3-1, дор.1). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 4693 п.н.
Рисунок 3-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 3-2, дорожка 1).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 2664 п.н.
Рисунок 3-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
