Нитратный репортер: PyeaR - GFP

Нитрат- или нитрит-чувствительный промотор PyeaR с GFP-кодирующим участком и сильным сайтом связывания рибосом (RBS) для создания нитрат-чувствительных систем, генерирующих сигнал посредством экспрессии GFP.

PyeaR в норме репрессируется NsrR, белком большинства клеток 'E. coli'. Нитраты или нитриты, поступающие в клетку, конвертируются в окись азота NO. NO связывается с NsrR и останавливает репрессию, позволяя нарабатываться GFP.

Оптимум концентрации нитратов в диапазоне of 0 - 20 mM (рассчитано по методу Miller)

Активность в диапазоне 0 - 10mM была определена путем измерения экспрессии GFP при увеличивающихся количествах азотнокислого калия, результаты ниже:

Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K381001

Выделение плазмидной ДНК

Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.

Определение концентрации

Методом горизонтального электрофореза (рисунок 1-1, дор.8). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3056 п.н.

Рисунок 1-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).

Рестрикционное картирование

Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 1-2, дорожка 8).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 1027 п.н.

Рисунок 1-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).