Стрессовый сенсор rrnB P1-LacI-pLac-mCherry

Сильный ответ у бактерий вызывает аминокислотное голодание, ограниченное поступление жирных кислот и железа, тепловой шок и некоторые другие стрессовые условия. Результаты исследований in vitro указывают на то, что в ответ на стресс увеличивается уровень молекулы ppGpp (alarmone guanosine tetraphosphate), модулирующей транскрипцию важных для выживания генов.

Схема конструкта для детекции стрессовых условий:

Карта плазмиды. Промоторы отмечены голубым, гены – стрелками.

Стрессовый сенсор сконструирован из следующих биобриков.

Литература

[1] Magnusson, L. U., A. Farewell, et al. (2005). "ppGpp: a global regulator in Escherichia coli." Trends Microbiol 13(5): 236-242

Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K639003

Разработчик: Eirik Selsaas   Группа: iGEM11_NTNU_Trondheim   (2011-08-26)

Выделение плазмидной ДНК

Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.

Определение концентрации

Методом горизонтального электрофореза (рисунок 9-1, дор.4). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 4819 п.н.

Рисунок 9-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).

Рестрикционное картирование

Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 9-2, дорожка 4).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 2790 п.н.

Рисунок 9-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).

Genbank-файл