«Усеченная» кодирующая последовательность лизостафина (Truncated lysostaphin coding sequence)
Лизостафин обладает литическим действием в отношении S.aureus.
Лизостафин – цинковый металлофермент со специфическим литическим действием в отношении S.aureus. Обладает тремя активностями: эндо-β-N-ацетил-глюкозамидазной, N-ацетил-мурамил-L-аланин-амидазной и гликоглицин эндопептидазной. Последняя приводит к лизису клеток стафилоккокка путем гидролиза гликоглициновых связей в полиглициновых мостиках, образующих сшивки в клеточной стенке бактерий. Натуральный лизостафин является проферментом, активация которого происходит при отщеплении гидрофильного участка. В данном «усеченном» фрамгенте эта последовательность удалена, чтобы происходила наработка «зрелой» формы фермента.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K748002
Разработчик: Lei Qiao Group: iGEM12_HIT-Harbin (2012-09-15)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 3-1, дор.10). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2811 п.н.
Рисунок 3-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 3-2, дорожка 10).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 782 п.н. На форезе присутствует фрагмент размером 2800 п.н. Возможно линеаризованная плазмида. Требуется проверка секвенированием.
Рисунок 3-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
