EPIC люцифераза светлячка и LRE P. Pyralis
Фрагмент является трансляционной единицей мутантной формы люциферазы североамериканского светлячка (P. pyralis) и и люциферин-регенерирующего фермента (LRE) из этого же насекомого.Конструкция находится под промотором индуцируемого арабинозой промотора (pBAD). Для получения люминисценции требуется D-люциферин.
Фрагмент оптимизирован по кодонам для экспрессии в E.coli.
Литература
[1]: S.M. Marques and J.C.G. Esteves da Silva, (2009) Firefly Bioluminescence: A Mechanistic Approach of Luciferase Catalyzed Reactions,Life 61, 6-17.
[2]: T. Nakatsu et al. (2006) Structural Basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence, Nature 440(16), 372-376.
[3]: K. Gomi and N. Kajiyama, (2001) Oxyluciferin, a Luminescence Product of Firefly Luciferase, Is Enzymatically Regenerated into Luciferin, The Journal of Biological Chemistry, 276(39), 36508-36513.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K325100
Разработчик: Ben Reeve and Paul Masset Группа: iGEM10_Cambridge (2010-09-15)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 4-1, дор.5). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 4696 п.н.
Рисунок 4-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 4-2, дорожка 5).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 2667 п.н. Требуется дополнительное картирование.
Рисунок 4-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
