Optogenetical AND-Gate blue light - without first promoter - choose your first input
This is part of an AND-gate where one can choose the first promoter which controls the supDtRNA. The logical gate is based on amber stop-codon suppression via the non-canonical tRNA supD (BBa_K228001). The blue light sensor (BBa_K238013) induces the expression of a mRNA coding for a T7-polymerase with an amber mutation (BBa_K228000), that can only be translated by ribosomes if the correct supD tRNA is present.
Применение в биологии
This part can be used, when one wants an AND-gate where the T7ptag (T7 polymerase with amber stop codon mutation) is under the control of a bluelight sensor. The part which controls the supDtRNA can be chosen individually and designed for specific experimental purposes. Blue light leads to dimerisation of YcgF and binding of the repressor YcgE. The formation of the YcgE-YcgF complex leads to the unbinding of YcgE from the YcgZ promoter which activates the transcription of T7ptag (T7 polymerase with the amber stop codon mutation) if enough supD tRNA is available. SupDtRNA is only produced once a chosen promoter is cloned at the 5'-site of the part.
The so constructed AND-gate should ensure that expression of T7ptag is only induced when two signals (one of them blue light) hit the part.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K568004
Разработчик: Team TU Munich 2011 Группа: iGEM11_TU_Munich (2011-09-14)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 4-1, дор.10). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 5139 п.н.
Рисунок 4-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 4-2, дорожка 10).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 3110 п.н.
Рисунок 4-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
