pLux-Lac:GFP:Term:Term:PluxR/cI-OR :mCherry:Term:PtetR:LuxR:Term:Plux/cI-OR:LuxI
Фрагмент представляет собой LuxR/LacO-регулируемый зеленый флюоресцентный белок GFP, LuxR/cI-регулируемый mCherry с LuxR/cI-регулируемой AHL амплификаией, TetR-регулируемой LuxR продукцией.
Part:BBa_K415300 и BBa_K415023
Фрагмент используется для получения красной и зеленой флюорецсенции при определенных условиях. Флюоресценция активируется присутствием одновременно LuxR и 3OC6HSL. LuxR в норме конститутивно экспрессируется, но может быть респрессирован TetR и aTc (частично). Зеленая флюоресценция репрессируется LacI, красная флюоресценция - CI.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K415023
Разработчик: Andrew Yang Группа: iGEM10_MIT (2010-07-24)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 3-1, дор.8). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 5792 п.н.
Рисунок 3-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 3-2, дорожка 8).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 3763 п.н. Для нашей плазмиды получили длины 2029 п.н., 1800 п.н. Требуется подтверждение секвенированием!!!
Рисунок 3-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
