Spider Silk 1x Subunit «W» с кодовым стартом Met (ATG)
Собственная последовательность субъединицы паука-паука; содержит одну область эластичности и одну прочную область, а стартовый кодон Met (ATG) на 5'-конце.
Использование в биологии
Последовательность для этой субъединицы была получена из субъединицы 2E шелка из Brooks et al. (2008), который основан на нативной последовательности гена Sils MaSp2 в Argiope aurantia. Дополнительную информацию о последовательности см. В разделе BBa_K844002. Эта часть содержит добавочный кодон Met (ATG) на 5'-конце и предназначена для использования в качестве первой субъединицы в удлинённой конструкции шелка. Эта часть должна сопровождаться многочисленными повторами субъединицы шелка BBa_K844002, а область кодирования шелка должна заканчиваться частью BBa_K844000, которая содержит метку 10-гистидина и двойной стоп-кодон (TAATAA)
Шелковая субъединица содержит четыре основных домена: две области эластичности, линкерный домен и прочный домен. Области эластичности содержат последовательности, кодирующие бета-спирали и бета-спираль в белке; эти структуры увеличивают эластичность шелка паука. Линкерная область объединяет области прочности и эластичности вместе. Прочный домен будет формировать бета-листы и укреплять шелковые волокна сшиванием шелковых нитей.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K844006
Разработчик: Federico Carlos Rodriguez Group: iGEM12_Utah_State (2012-10-02)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 101-1, дор.10). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2193 п.н.
Рисунок 101-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом вертикального электрофореза в 7% ПААГ (рисунок 10-2, дорожка 10).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 164 п.н. Не совпадает длина!!! Требуется подтверждение секвенированием!!!
Рисунок 10-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p400 (100, 200, 300, 400х2, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 п.н.).
