XylE – катехол-2,3-диоксигеназа из P.putida с терминатором
Продукт расщепления катехолового кольца - 2-гидроксимуконатный полуальдегид – цитотоксическое соединение, окрашенное в ярко-желтый цвет. Катехол-2,3-диоксигеназа – ключевой фермент многих почвенных бактерий, впервые изолированная из Pseudomonas putida. Фермент активен только в форме гомотетрамера.Активный центр связывает ионы железа. Реакция происходит за секунды. Другой вохможный субстрат - протокатехиновая кислота.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K316003
Разработчик: IC 2010 Team группа: iGEM10_Imperial_College_London (2010-10-22)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 3-1, дор.9). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3131 п.н.
Рисунок 3-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 3-2, дорожка 9).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 1082 п.н. Для нашей плазмиды получили длины 2029 п.н., 1800 п.н. Требуется подтверждение секвенированием!!!
Рисунок 3-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
