Yeast exportable His-rich peptide w/enhanced import (1)
Изначально разработано для использования в Yeast chassis, поэтому состоит из субфрагментов для дрожжевой экспрессии.
Структура девайса:
- Kozak консенсусная последовательность для инициации трансляции (из yeast α-factor mating pheromone (MFα1))
- Сигнальный пептид для секреции (также из from yeast α-factor mating pheromone (MFα1))
- Троянский пептид для итернализации в таргетную клетку (из HIV TAT penetratin)
- Payload: экспортируемый Histidine-богатый домен белка (His-Tag)
Эта часть была получена с использованием прямого синтеза ДНК, поэтому он не содержит шрамов от стандартного сборочного стандарта ВВ.
Этот девайс содержит троянский пептид BBa_K792003. Требуются меры предосторожности: избегайте прямого контакта и утилизируйте как патоген!
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K792009
Разработчик: Manuel Gim�nez Группа: iGEM12_Buenos_Aires (2012-09-25)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 101-1, дор.7). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2232 п.н.
Рисунок 101-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом вертикального электрофореза в 7% ПААГ (рисунок 10-2, дорожка 7).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 203 п.н.
Рисунок 10-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p400 (100, 200, 300, 400х2, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 п.н.).
