Генератор красного флюоресцентного белка
Генератор красного флюоресцентного белка с высокоэффективным сайтом связывания рибосом BBa_B0030 (из Community Collection) и двойным терминатором. Этот элемент может быть использован для измерения относительной силы промоторов или эффективности сайтов связывания рибосом по отнощению к целевому промотору.
Чтобы собрать конструкцию для измерения, необходимо собрать стандартный биобрик-промотор с этим элементом (или другим из коллекции: BBa_K516031 ; BBa_K516032)
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K516030
Разработчик: Nicolo' Politi, Federica Sampietro, Davide Bianchini Group: iGEM11_UNIPV-Pavia (2011-09-08)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 1-1, дор.4). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2934 п.н.
Рисунок 1-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 1-2, дорожка 4).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 905 п.н.
Рисунок 1-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
