Голубой флюоресцентный белок с сайтом связывания рибосом
Голубой флюоресцентный белок (Blue Fluorescent Protein, BFP, BBa_K592100) с сайтом связывания рибосом B0034. Может быть использован с любым промотором.
Мы предположили, что уровень экспрессии mTagBFP зависит от наличия или отсутствия терминатора. Чтобы проверить это, мы сравнили флуоресценцию от генераторов BFP с терминатором и без него. Результаты экспериментов показали, что голубая флюоресценция снижалась в случае, когда транскрипция не была не была должным образом терминирована.
Мы модифицировали BBa_K592024 (BBa_B0034-BBa_K592100), добавив терминатор BBa_B1006 3’. Таким образом мы надеялись получить репортер лучшего качества. Результаты экспериментов на рис.1.
*Улучшенная версия фрагмента по ссылке BBa_K1899002.
Figure 1. Сравнение уровней экспрессии генераторов BFP с терминатором и без него. (a) Схема эксперимента. (b) Результаты эксперимента. Усы на диаграмме отображают стандартную ошибку 3 независимых экспериментов, выполненных за 3 дня.
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K592024
Разработчик: Lei Sun Группа: iGEM11_Uppsala-Sweden (2011-09-21)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 1-1, дор.11). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2793 п.н.
Рисунок 1-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 1-2, дорожка 11).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 764 п.н.
Рисунок 1-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
