Конститутивный промотор [J23101] с mRFP (Red Fluorescent Protein), RBS B0032
Protein Generator, регулируемый конститутивным промотором BBa_J23101 с RBS средней эффективности BBa_B0032, mRFP репортер-кодирующим регионом и двойным терминатором транскрипции.
BBa_J23101 – референсный стандартный промотор для вычисления RPUs.
Фрагмент также используется для оценки эффективности RBS (BBa_K516130; BBa_K516131).
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K516132
Разработчик: Susanna Zucca, Federica Sampietro, Giuseppe Bertoni Group: iGEM11_UNIPV-Pavia (2011-09-08)
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 9-1, дор.6). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 2975 п.н.
Рисунок 9-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 9-2, дорожка 6).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 946 п.н.
Рисунок 9-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
