Промежуточная конструкция pSB1C3-BBa_ S04617
Промежуточная конструкция, состоящая из
- FixK2 promoter. FixK2-промотор представляет собой промотор дикого типа, к которому присоединяется фосфо-FixJ. FixJ, в свою очередь, может регулироваться YF1, синим светочувствительным белком. Этот промотор проявляет очень мало «протекающей» активности в отсутствие FixJ.
- RBS (Elowitz 1999) -- defines RBS efficiency
- cI repressor from E. coli phage lambda (+LVA)
- Кодирующая область для cI-репрессора из бактериофага лямбда, модифицированного хвостом LVA для быстрой деградации белка. cI репрессор связывается с регулятором cI (BBa_R0051).
- promoter (lambda cI regulated) Сильный промотер. [jb, 5/24/04] CI-регулируемый промотор основан на pR-промоторе из бактериофага лямбда. Промотор имеет два участка связывания ДНК для лямбда-cI-репрессора BBa_C0051. cI связывание приводит к репрессии транскрипции. Конкретная последовательность, используемая здесь, основана на CI-репрессируемом промоторе, используемом в репрессиляторе Elowitz. Исходное значение шума: 0,0869 (ср. С R0010: 0,0707; R0011: 0,0040). См. William_and_Mary iGEM 2015
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_S04617
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 1-1, дор.5). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3315 п.н.
Рисунок 1-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 1-2, дорожка 5).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 1286 п.н.
Рисунок 1-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
