Термочувствительный промотор
Это теплочувствительный композиционный элемент состоит из сильного конститутивного промотора (BBa_J23114) и термочувствительного репрессорного белка λ cI (BBa_K098997), несущего мутацию cI857, приводящую к денатурации репрессора при температуре 42°C, и cI-регулируемого промотора, основанного на промоторе λ pR (BBa_R0051). Он может быть использован для создания теплоиндуцируемой системы, если репортер или индикатор добавляется справа от этой части.
Основано на фрагменте (BBa_K098995). Поскольку секвенирование фрагмента (BBa_K098995) показало отсутствие нуклеотидов между сайтом связывания рибосом (RBS) и стартовым кодоном кодирующей последовательности термочувствительного репрессора λ cI (BBa_K098997) была проведена дополнительная вставка нуклеотидов.
 |
 |
| Функционирование термочувствительного промотора при 28-30°C | Функционирование термочувствительного промотора при 42°C |
Источник: http://parts.igem.org/Part:BBa_K608351
Выделение плазмидной ДНК
Проводилась трансформация клеток E. coli, штамм Nova-Blue (Novagen). Снятую с агара бактериальную колонию выращивали в среде LB (200 мл) в течении 18 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным лизисом. Дополнительно обрабатывали полученную плазмидную ДНК РНКазой, проводили фенол-хлороформную экстракцию и осаждение этанолом.
Определение концентрации
Методом горизонтального электрофореза (рисунок 1-1, дор.6). Нанесение 1 мкл плазмидной ДНК. Длина линейной формы плазмиды 3018 п.н.
Рисунок 1-1. Электрофореграмма плазмидной ДНК. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
Рестрикционное картирование
Рестрикционное картирование проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, PstI. Разделение продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле (рисунок 1-2, дорожка 6).Ожидаемая длина фрагментов 2029 п.н., 989 п.н.
Рисунок 1-2. Электрофореграмма продуктов рестрикции. М – маркерная лестница p250 (250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 п.н.).
